农贸（集贸）市场是新冠肺炎疫情防控的重点场所，加强对农贸（集贸）市场新冠病毒环境监测，对于深入开展病毒溯源和疫情防控意义重大。为科学规范指导开展农贸（集贸）市场新冠病毒环境监测工作，特制定本技术规范。

监测重点为具备区域辐射能力的大型农贸（集贸）市场，特别是包括冷冻、冷藏功能的肉类和海鲜水产交易摊位，或者存在潮湿、密闭空间的市场。

（一）市场内重点摊位的设施、用具表面病毒检测。重点对摊位台面、面板、地面、把手，以及各种制作和使用器具等表面，包括脱毛或切割机械、刀具等，采集拭子样本。

（二）市场内重点摊位从业人员咽拭子、衣物表面、手部病毒检测。对处于工作状态的从业人员手部表面，采集拭子样本。

（三）市场内重点摊位存放食品的冰箱、冷藏柜内部表面病毒检测。对储藏食物过程中经常触及的冰箱、冷藏柜内表面，采集拭子样本。

（四）市场内销售的肉、禽类和海鲜水产类食品的病毒检测。对市场内销售的食品应当按照无包装食品和有包装食品加以区分，其中有包装类食品重点是需要冷藏运输的肉、禽类和海鲜水产类食品，采集拭子样本。

（五）市场内排水系统中污水的病毒检测。重点包括市场内海鲜水产、肉禽类产品摊位来源的污水，采集拭子样本或污水样本。

（六）市场内公共空间中人员接触较多的部位，包括主要进出口的电梯按钮、楼梯扶手、门把手表面，茶水间、卫生间等公用设备设施表面，潮湿的公共通道和卫生间地面、墩布池等采集拭子样本。

（七）市场内经常性跨区域移动的工具或物品，包括垃圾车、垃圾桶、墩布等清洁工具，转运物品的拖车等，采集拭子样本。

（八）市场内工作人员聚集、通风不良的环境，包括办公室、工具间、休息间、局部交易环境等环境拭子及气溶胶样本。

（一）样本要求。

1.从业人员咽拭子、手部、衣物和其他物体表面拭子样本：要求用病毒采样管中的病毒保存液，充分浸润采样棉签后，对拟采集的手部或物体（包括公共通道的地面）的表面重复涂抹、涮洗3次以上。同时要满足对采样对象表面，进行多点分布式采样。

2.食品表面拭子样本：食品样本不可直接进行采集，应当首先将拟采集的食品小心分离，并存放于洁净采样袋后，再进行拭子样本的采集。要求用病毒采样管中的病毒保存液，充分浸润采样棉签后，对拟采集食物样本的表面重复涂抹、涮洗3次以上。同时要满足对样本表面，进行多点分布式采样。

3.污水样本：按照市场内排水系统分布情况，选取2-3处污水采样位置，重点为内部管网汇集处、水流方向的下游或与市政管网的连接处。采集拭子样本要求，用采样棉签浸入污水中，使其吸附污水并在采样管中对涮洗3次以上。采集污水样本要求，用聚乙烯塑料瓶收集30-500mL污水水样；大于500mL体积的污水采集可以使用聚乙烯塑料桶或现场水样专用富集设备。同时要满足对污水采样位置，进行多点分布式采样。

4.动物样本：对于活体动物，可分别用采样棉签采集其体表拭子、口咽拭子和肛拭子，也可以采集其排泄物或分泌物样本，并在记录单上进行相应记录。对于以经过剥皮等处理的动物样本，分别用棉签采集其体表和体腔拭子样本，要求用病毒采样管中的病毒保存液，充分浸润采样棉签后，对拟采集食物样本的表面重复涂抹、涮洗3次以上。同时要满足对样本表面，进行多点分布式采样。

5.其他器具：笼具或鱼缸等装运、养殖动物的容器，需首先观察或了解该容器具体存放、养殖过的动物类型，采集容器内壁拭子样本或内容物液体样本。

6.人员聚集、通风不良的局部交易区域、办公室、休息间等环境采集气溶胶样本。

（二）采样方法。

1.采样周期：对重点大型集贸市场（特别是销售生鲜类产品的市场）按照1次/周，对其余需要监测的集贸市场按照1次/月的频次进行病毒监测。

2.采样实施：现场采样由两名以上的工作人员参与完成，采样时应当穿戴防护服、防护口罩、鞋套和医用一次性手套。采样过程需开启现场采样视频记录设备。

3.采样装备：病毒采样箱、病毒采样管、气溶胶采集器、样品记录单、手消设备、洁净采样袋、冰袋、高危险生物样本转运箱和生物安全垃圾袋等。

4.采样记录：样本信息应当包括样本采集的采样时间、地点、集贸市场名称、摊位编号、采样类型、样本编号以及采样人等信息。

5.采样操作：采样开始前，要求穿戴防护服、口罩、鞋套和手套等个人防护用品进入采样现场，并使用手消进行手部消毒。拭子样本采样过程中，采样棉签只能接触当前采集的样本，避免触碰到其他物体。污水样本采集前，先充分搅匀，然后取样。污水分三层以上，不能搅匀时，可按各层量的多少的比例分层取样。气溶胶样本采集使用气溶胶采集器，设定采集高度、空气通量和采集时间，进行气溶胶采集，将采集后的吸收液或滤膜放置在特定的低温容器进行转运。采样结束后，清理废弃物后离场。

6.样品转运：采集样品连同采样记录单应当在24小时内运送至当地指定的病毒监测机构进行检测，样本建议冷藏存放于高危险生物样本转运箱中，并由专人、专车进行转运。

（一）样本分装和保存。

1.样本分装：标本采集后应当在生物安全二级实验室生物安全柜内分装，但个人防护装备参照生物安全三级实验室的防护要求。所有采集对环境标本应当分装到大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，按照1000ul/管进行分装。容器(采集管)外注明样本编号、种类及采样日期。用于后续核酸提取和病毒分离等实验室检测工作。

2.样本保存：用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应当置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。

（二）污水水样前期处理。使用离心技术去除污水中杂质。先打开低温离心机，待温度降至4℃左右，建议4654离心力离心30分钟，取上清。再使用膜吸附技术或超滤技术进行上清液的浓缩。

（三）核酸提取。新型冠状病毒的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR鉴定。任何新型冠状病毒的检测都必须由经过相关生物安全及技能培训的人员进行操作。对已经灭活的样本，应当在生物安全二级（BSL-2）实验室内，使用自动化核酸提取仪，配套核酸提取试剂盒进行病毒核酸的提取。核酸提取后，应当将核酸产物进行分装，用于后续核酸实时荧光定量（RT-PCR）及深度测序。核酸提取操作参考相关厂家试剂盒说明书开展。

（四）实时荧光定量PCR。在BSL-2实验室中对所有已提取的核酸样本，应当用经CFDA批准的RT-PCR诊断试剂进行新型冠状病毒核酸检测，以保证实验结果的正确可靠。RT-PCR反应体系和操作参考相关厂家试剂盒说明。每一次RT-PCR反应均应当设置阴性对照、阳性对照和无模板空白对照，以确保扩增体系工作正常。

实验室安全级别参照最新版《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》的相关内容进行管理。采集的环境样本属于未经培养的感染性材料，在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸提取、生化分析，以及临床样本的灭活等操作，应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。环境样本在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安全二级实验室进行。
 
附表：新型冠状病毒环境检测标本送检表